操作规程

1. 开机：打开Flowsight主机和两个电脑的电源，双击FlowSight-INSPIRE软件图标、启动。

2. 检查鞘液、清洗液等是否足够，将废液桶清空。

3. 单击软件界面右下方的Start up，仪器会自动冲洗管路、将鞘液装载到液流系统中，此过程大概要花费10 min

4. 点击Load，在1.5 ml或者0.5 ml离心管中加入两滴FlowSight Calibration Beads、混匀，放到上样孔中，仪器会自动吸取Beads。

5. 系统自检：等待Beads运行稳定后，在ASSIST界面中点击Start all calibrations and tests，仪器自动对系统状态进行检测，此过程大概花费15 min。

6. 在File中选择Load default template或者已有模板。

7. 点击Load，在1.5 ml或者0.5 ml离心管中加入样品（每种染料都标记）。

8. 在Illumination界面中，打开本次实验要用的所有激光器。

9. 调整激光机的功率使得荧光值最大，但又不处于过饱和状态：激光器调节原则为使相应荧光通道的Raw Max Pixel为100-4000之间。

10. 在Plot界面中，生成点图（dot plot）或者直方图（histogram）用于选择数据获取所需的细胞群体。

11. 在acquisition parameters中选择数据保存的文件名称、文件夹、想要获取的细胞群及细胞数（也可以选择保存所有细胞的数据）。

12. 在File中选择文件的保存格式：.rif (IDEAS)，.fcs (FACS software)。

13. 点击Acquire获取数据，按照这样设置和方法，依次获取、保存所有样品的数据。

14. 荧光补偿：两种方式-在线和离线荧光补偿，所需样本-单阳性。

在线荧光补偿

1)点击creat compensation matrix。

2)点击Load，将一个对照单阳性样本放到上样孔中。

3)确定系统选择的荧光检测通道是否正确。

4)设定要获取的细胞数、文件、文件名，点击Next开始获取数据。

5)重复2-5步获取其他单阳性对照样品数据。

6)点击Exit，保存荧光补偿文件，其文件类型为.ctm。

7)使用方法:

a)使用一个标记了所有荧光素的样本调节仪器条件。

b)按照在线荧光补偿所述步骤生成荧光补偿文件。

c)在获取其他样本数据时可以点击compensation中的Load Matrix调用荧光补偿文件，此后样本数据皆为荧光补偿后的结果。

离线荧光补偿

1)关闭785 nm激光器和Brightfield。

2)点击Load，将一个对照单阳性样本放到上样孔中。

3)获取细胞范围选择All，设定要获取的细胞数（建议为500-1000）、文件、文件名（建议为荧光素名称）。

4)点击Acquire获取数据，获取数据的文件系统会自动添加noBF尾缀。

5)重复2-4步获取其他单阳性对照样品数据。

6)使用方法:

a)使用一个标记了所有荧光素的样本调节仪器条件。

b)使用该条件获取其他所有样本数据。

c)在该条件下，按照离线荧光补偿所述步骤获取单阳性样本数据。

d)在使用IDEAS软件分析数据时生成荧光补偿文件。

15. 保存实验条件：点击File中的save template、保存本次实验条件；可以在做类似实验时，点击file中的boad template、调取实验条件。

16. 关闭系统：点击Shutdown，仪器自动清洗、关闭系统，此过程大概花费40 min

注意事项

1. 保持一定的使用频率，最好保证仪器每周运行。如没有实验，可以正常运行开机(Startup)、关机(Shutdown)一次。

2. 如长期不使用仪器(超过一周)，再次使用时，在starup之后，运行清洗消毒2-3次后再做实验：点击Shutdown，取消√。

3. 上样时请注意打开管盖，否则会导致上样器损伤。

4. 不要使用BD或者Beckman等公司的鞘液。